显微镜分辨率：概念、因素和计算

　　在显微镜学中，‘分辨率’一词用于阐述显微镜对细节进行区分的能力。换言之，这是样本内两个能被观察人员或者显微镜摄像头区分的实体点之间的最小距离。

　　显微镜的分辨率本质上与光学元件的数值孔径（NA）以及用于观察样本标本的光波长有关。此外，我们必须考虑Ernst Abbe于1873年首次提出的衍射极限。

　　分辨率与数值孔径。

　　数值孔径（NA）与光通过的介质的折射率（n）以及给定物镜的孔径角（α）有关（NA=n × sin α）。显微镜的分辨率不仅取决于物镜的NA，还取决于整个系统的NA，要把显微镜聚光镜的NA也纳入考虑。在显微镜系统中，所有光学元件都正确对齐、具有相对较高的NA值并且相互协调工作，可以分辨出更多的图像细节。分辨率还与标本成像所用的光波长有关；波长越短，可分辨的细节越多，波长越长则分辨细节越少。

　　在处理分辨率时需要考虑三个数学概念：‘阿贝衍射极限’、‘艾里斑’和‘瑞利判据’。以下按时间顺序逐一介绍。

　　如何计算显微镜的分辨率

　　将以上全部理论都考虑在内就可以明显看出，在计算分辨率的理论极限时需要考虑很多因素。分辨率还取决于样本性质。我们来看一下使用阿贝衍射极限以及使用瑞利判据进行的分辨率计算。

　　首先应当要牢记：

　　NA= n x sin α

　　式中n为成像介质的折射率，α是物镜孔径角的一半。物镜的最大孔径角大约为144?。该角度一半的正弦为0.95。如果使用油浸物镜且折射率为1.52，则物镜的最大NA为1.45。如果使用‘干式’（无浸没）物镜，则物镜最大NA为0.95（因为空气的折射率为1.0）。

　　横向（即XY）分辨率的阿贝衍射公式为：

　　d= λ/2 NA

　　式中λ 是标本成像所用的光波长。如果使用514 nm的绿光及NA为1.45的油浸物镜，则分辨率的（理论）极限将达到177 nm。

　　轴向（即Z）分辨率的阿贝衍射公式为：

　　d= 2 λ/NA2

　　同样的，如果我们假设通过波长514 nm的光来观察标本且物镜NA数值为1.45，则轴向分辨率为488 nm。